Существует множество методов исследования , среди которых выделяются следующие: наблюдение за живыми зародышами с применением кино- и видеосъемки (используется в основном в эксперименте). Для этого применяется специальная микрофотоустановка, соединяющаяся с термокамерой, в которой развивается зародыш. При изучении развития куриного эмбриона, например, в скорлупе проделываете» окошечко, которое закрывается прозрачной пластинкой. Данный метод позволил проследить и уточнить динамику изменения формы и размеров зародышей в процессе развития.
Метод изучения фиксированных срезов зародышей с помощью световой и электронной микроскопии, гисторадиоавтографии, гисто- и иммуноцитохимии. Эти методы позволяют анализировать тканевые и внутриклеточные изменения в динамике развития частей зародыша. С помощью гисто- и иммуноцитохимических методов исследуются биохимические процессы, происходящие в клетках зародышей, - синтез ДНК, РНК, белков, специфических рецепторных белков и др. С применением этих методов была получена важная информация о клеточной и тканевой дифференцировке в развитии эмбрионов и плодов.
Метод маркировки , предложенный в 1925 г. В. Фогтом (1888-1941), позволяет изучать перемещения клеток в развивающемся зародыше. Для этого применяются нетоксичные для зародышей маркеры (например, нейтральный красный, частицы древесного угля), а также антитела к определенным белкам. При применении антител используется их свойство соединяться с флюоресцирующим красителем и белками зародыша. С помощью флюоресцентной микроскопии прослеживается распределение красителя и исследуется динамика белкового синтеза в развивающихся тканях зародыша.
Методы микрохирургии разрабатывались в начале XX века представителями школы Г. Шпемана (1869-1941). Они включали: снятие оболочек яиц животных, пересадку частей одного зародыша другому и др. Данные методы используются также для изучения последствий разрушения (например, с помощью лазерного луча) частей зародыша или его отдельных клеток. Трансплантацию как разновидность микрохирургии используют для выявления путей миграции клеток и источников развития тканей. При этом пересаживают участок зародыша, например перепела, в тот же участок куриного зародыша на место удаленного участка. Ядра клеток перепела имеют характерную структуру и поэтому отличимы от ядер клеток зародыша курицы.
Эксплантация - иссечение небольшого участка зародыша и выращивание его на искусственной среде. С помощью этого метода можно получать информацию об источниках развития тканей из данного участка зародыша и выявлять гистогенетические закономерности развития.
Трансплантация ядер - метод, позволяющий клонировать зародышей. Например, пересадка ядер из клеток эпителия кишки головастика шпорцевой лягушки в икринку лягушки, ядро которой было инактивированно ультрафиолетовым лучом, привела к появлению новых особей (опыты Гердон). Данные опыты заложили основу клонирования высших позвоночных и способствовали появлению (в 1997 г.) знаменитой овцы Долли. Подобные эмбриологические эксперименты убедительно показали, что ядра соматических клеток содержат полный набор генетической информации для развития нового организма.
Новейшим достижением экспериментальной эмбриологии явилась разработка метода экстракорпорального оплодотворения. Пересадка зародышей, зачатых в пробирке, в матку составляет основу лечения бесплодия. В 1973 г. Л. Шеттлз (США) извлек предовуляторную яйцеклетку из яичника бесплодной женщины и оплодотворил ее сперматозоидами мужа. Так было положено начало технике пересадки зародышей человека с целью лечения бесплодия. Однако только в 1978 г. в Великобритании в результате успешной пересадки в матку бесплодной женщины зародыша человека на стадии 8 бластомеров после 2,5 суток культивирования появился первый в мире "пробирочный" ребенок массой 2700 г.
2. Объекты исследования гистологии
3. Приготовление гистологических препаратов
4. Методы исследования
5. Исторические этапы развития гистологии
1. Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов. Следовательно, гистология изучает один из уровней организации живой материи тканевой. Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:
клеточный;
тканевой;
структурно-функциональные единицы органов;
органный уровень;
системный уровень;
организменный уровень
Гистология, как учебная дисциплина , включает в себя следующие разделы: цитологию, эмбриологию, общую гистологию (изучает строение и функции тканей), частную гистологию (изучает микроскопическое строение органов).
Основным объектом изучения гистологии является организм здорового человека и потому данная учебная дисциплина именуется как гистология человека.
Основная задача гистологии состоит в изучении строения клеток, тканей, органов, установления связей между различными явлениями, установление общих закономерностей.
Гистология, как и анатомия, относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом, изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры. Наконец, изучаемые структуры обычно рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном (эмбриональном) периоде, так и на протяжении постэмбрионального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения эмбриологии в курс гистологии.
Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.
2. Объекты исследования подразделяются на:
живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);
мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.
В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.
Гистологический препарат может быть в виде:
тонкого окрашенного среза органа или ткани;
мазка на стекле;
отпечатка на стекле с разлома органа;
тонкого пленочного препарата.
Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:
сохранять прижизненное состояние структур;
быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;
быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;
препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.
Эти требования достигаются при приготовлении препарата.
3. Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата
Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа; забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка; обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).
Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.
Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.
Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.
Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.
Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.
После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.
Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.
Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.
Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.
Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.
4. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:
световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;
ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);
люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;
фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;
поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;
микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;
микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;
электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.
Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.
Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.
Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.
Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.
Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.
Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.
Единицы измерения, используемые в гистологии
Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.
5. В истории развития гистологии условно выделяют три периода:
Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.
Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге "Микрография", в-третьих, впервые ввел термин "клетка" ("целлюля"). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.
Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках "протоплазмы" (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:
все растительные и животные организмы состоят из клеток;
все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;
каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.
Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.
Современные положения клеточной теории:
клетка является наименьшей единицей живого;
клетки животных организмов сходны по своему строению;
размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;
многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.
Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:
клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;
сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;
митохондрии Бенда, 1898 г.
Современный этап развития гистологии начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.
ЛЕКЦИЯ 2. Цитология. Цитоплазма
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФГБОУ ВПО «САХАЛИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНЫЙ ФАКУЛЬТЕТ
КАФЕДРА ЭКОЛОГИИ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ
КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА
по дисциплине «Гистология и эмбриология рыб
на тему «Методы исследования в гистологии»
Студент 2 курса
Терехов Степан Сергеевич
Научный руководитель,
ст. преподаватель кафедры экологии и природопользования
А.В. Бойко
Южно-Сахалинск
Введение
Гистология - наука об особенностях организации, функций и развития тканей и тканевом строении органов. Основным объектом изучения гистологии служат ткани, которые представляют собой филогенетически сложившиеся, топографически и функционально связанные клеточные системы и их производные, из которых образованы органы. Для того что бы понять как это всё устроено и работает, человечеству понадобилось пройти через многое, начиная с линз Антони Ванн Левенгука, когда было положено начало изучению всего живого, не видимое ранее. К современным же методам изучения, относят основной, микроскопирование.
Цель работы: Рассмотреть методы исследования в гистологии, научиться работать с гистологическими препаратами и понимать сам процесс изучения тканей различными способами микроскопирования.
1. Методы исследования в гистологии, основа
В зависимости от объекта изучения гистологию подразделяют на нормальную (изучает ткани здорового организма) и патологическую (патогистологию), которая исследует изменения тканей при заболеваниях и повреждениях (ее обычно рассматривают как раздел патологической анатомии). В силу специфики объекта и методов исследования выделяют нейрогистологию, а также учение о крови и кроветворении, ставшее теоретической основой гематологии. Кроме того, различают ряд направлений в гистологии - описательную гистологию (описание тканей), сравнительную гистологию (сравнение тканей различных видов животных), эволюционную гистологию (закономерности развития тканей в филогенезе), экологическую гистологию (изучает ткани в связи с воздействием условий обитания), экспериментальную гистологию. В гистологии используют многочисленные методы исследования - микроскопию, экспериментальный, тканевых культур (Афанасьев 1989).
Основной предмет изучения гистологии - комплексы клеток, составляющие ткани, в их взаимодействии друг с другом и с промежуточными средами. Являясь частью морфологии, гистология тесно связана с цитологией, анатомией, эмбриологией. Методологическую основу гистологии составляют клеточная теория и эволюционное учение. Гистологию принято разделять на общую (изучает общие закономерности развития, строения и функции тканей) и частную (изучает микроскопическое строение отдельных органов и систем организма). Специальными разделами гистологии являются гистохимия (химия тканей) и гистофизиология (механизмы деятельности тканей) (Юшканцева 2006).
2. Методы исследования
Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов с последующим их изучением с помощью светового или электронного микроскопа. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, тонкие срезы кусочков органов, возможно, окрашенные специальным красителем, помещенные на предметное стекло микроскопа, заключенные в консервирующую среду и покрытые покровным стеклом.
В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.
Главными этапами гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопирования, а также качественный и количественный анализ изображений.
Объектами исследования служат живые и мертвые (фиксированные) клетки и ткани, и их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах.
Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок(например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости и др.),отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты: фиксированные, заключенные в твердую среду и окрашенные (Юрина 1999).
Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:
взятие материала и его фиксация,
уплотнение материала,
приготовление срезов,
окрашивание или контрастирование срезов.
Для световой микроскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды.
Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.
Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте.
Приготовление срезов происходит на специальных приборах - микротомах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии).
Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.
Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными - базофильными. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток - окрашиваются базофильно.
Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет (Юрина, Радостина 1999).
В электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.
3. Методы микроскопирования гистологических препаратов
Микроскопия может быть световая (с использованием светового микроскопа) иэлектронная (с использованием электронного микроскопа). Световая микроскопия может осуществляться в проходящем свете, когда свет проходит через тонкий прозрачный гистологический препарат, или же в отраженном свете, когда исследуют, например, толстый или непрозрачный объект. Аналогичным образом, электронная микроскопия может быть трансмиссионной, когда пучок электронов проходит сквозь изучаемый ультратонкий срез, или же растровой, или сканирующей, когда пучок электронов отражается от поверхности исследуемого объекта. В первом случае электронный микроскоп называется трансмиссионным (ТЭМ), а во втором - сканирующим (СЭМ).
1 Световая микроскопия
Микроскопирование - основной метод изучения препаратов - используется в биологии уже более 300 лет. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью и позволяющие изучать очень тонкие детали строения клеток и тканей. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d0). В основном оно зависит от длины световой волны ?, и эта зависимость приближенно выражается формулой d0 = ? / 2. Таким образом, чем меньше длина световой волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам структуры можно видеть в препарате (т.е. выше «разрешение» микроскопа). Понятие «увеличение микроскопа» относится к его оптической системе и выражается в произведении увеличений объектива и окуляра. Однако «разрешение» микроскопа зависит от характеристик объектива и не зависит от окуляра.
Для изучения гистологических препаратов чаще применяют обычные световые микроскопы различных марок, когда в качестве источника освещения используют естественный или искусственный свет. Минимальная длина волны видимой части спектра света соответствует примерно 0,4 мкм (фиолетовый спектр). Следовательно, для обычного светового микроскопа разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) достигает 2000 раз.
Единицы измерения, используемые в гистологии: Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм (Юшканцева 2006)
2 Ультрафиолетовая микроскопия
Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (т.к. люминесцентный экран, или электронно-оптический преобразователь) (Юрина 1999)
3 Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия
Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с другой, большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны вызванной флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой. Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами <#"justify">Артишевский, А. А. Гистология с техникой гистологических
исследований (1999)
Антипчук, Ю. П. Гистология с основами эмбриологии (1983)
Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. - Гистология, цитология и эмбриология (1989) "Медицина"
Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. - Гистология, цитология и эмбриология (2002) "Медицина"
Быков В.Л. Частная гистология человека "Сотис" 1999
Заварзин А.А., Строева О.Г. - Сравнительная гистология. Учебник "СпБ" 2000
Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н. - Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии "МИА" 2002
Рябов, К. П. Гистология с основами эмбриологии: учебное пособие (1990)
Улумбеков Э.Г., Челышев Ю.А. - Гистология. Учебник для ВУЗов (1997) "Геотар" 1997
Челышев Ю.А. - Графические тесты по гистологии, цитологии, эмбриологии "КГМУ" 2000
Юрина Н.А., Радостина А.И. - Практикум по гистологии, цитологии и эмбриологии "УДН" 1999
Юшканцева С.И., Быков В.Л. - Гистология, цитология и эмбриология. Краткий атлас "П-2" 2006
Репетиторство
Нужна помощь по изучению какой-либы темы?
Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку
с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.
1. Методы исследования в гистологии .
Как любая наука гистология располагает своим арсеналом методов исследований:
I. Основной метод - микроскопирование.
А. Световая микроскопия - исследования обычным световым мик-пом.
Б. Спец-ые методы микроскопирования:
Фазовоконтрастный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)
Темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)
Люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов)
Ультрафиолетовый мик-п (повышает разрешающую способность м-па)
Поляризационный мик-п(для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т.д.)
Интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в
клетках, определение толщины обьектов)
В. Электронная микроскопия:
Трансмиционная (изучение обьектов на просвет)
Сканирующий (изучение поверхности обьектов)
II. Специальные (немикроскопические) методы:
1.Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа.
2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т.д.
3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат.
4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов.
5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.
6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т.д.)
6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма.
7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности.
8. Экспериментальный метод.
9. Метод трансплантации тканей и органов.
2. В своих исследованиях эмбриология использует ряд методов: описательный, экспериментальный и сравнительно-морфологический.
Описательный метод состоит в наблюдении изменений, происходящих при развитии особи. Описание их было необходимо предпосылкой возникновения экспериментального и сравнительно-морфологического методов.Сравнительно-морфологический метод состоит в сопоставлении эмбриональных стадий разных животных. С его помощью устанавливается сходство между этапами развития различных видов животных, чем значительно расширяет значение описательного метода.
Экспериментальный метод - раздел эмбриологии, изучающий процесс эмбриогенеза в различных экспериментальных условиях с целью поиска путей и методов целенаправленного воздействия на него. Применение экспериментальных методов исследования позволяет установить причины нарушения нормального индивидуального развития, выявить условия, определяющие нормальное развитие организма, а также активно вмешиваться в этот процесс. заключается в изучении развития особи в искусственно измененных условиях или в условиях нарушения типичных соотношений между ее частями. Последнее осуществляется путем пересадок (трансплантации) зачатков органов в необычные для них области зародыша. Экспериментальное исследование открывает широкие возможности для направленного изменения формообразовательных процессов в интересах человека. В экспериментальной эмбриологии применяются различные методы: такие как разделение зародыша на части и прослеживание дальнейшего развития этих частей, пересадка частей одного зародыша другому, изменение хим. состава среды, в которой происходит развитие, метод маркировки (метки) частей зародыша безвредными красителями и др. Метод культивирования тканей и зачатков органов вне организма позволяет раскрыть не только механизмы цитодифференцировки и взаимодействия клеток и тканей в процессе развития, но и оценить прямое действие тех или иных агентов, в т. ч. лекарственных средств, на развивающиеся структуры. С помощью экспериментальной эмбриологии разработаны методы хранения (замораживания) спермы и яйцеклеток, пересадка эмбрионов. Новейшим достижением экспериментальной эмбриологии явилась разработка метода экстракорпорального оплодотворения. Пересадка зародышей, зачатых в пробирке, в матку составляет основу лечения бесплодия.
Соответственно применяемым методам исследования эмбриологию разделяют на описательную, сравнительно-описательную и экспериментальную.
3. Вклад отечественных ученых в развитие гистологии
Началом развития русской гистологии надо считать 30-ые годы 19 века, когда гистология преподавалась на кафедрах анатомии и физиологии. В 60 гг 19 в гистология выделилась в отдельные кафедры. Первая кафедра гистологии создавалась в МГУ - зав.каф. А.И.Бабухин. Школа Бабухина занималась вопросами гистогенеза и гистофизиологии мышечной и нервной ткани.
Почти параллельно открылась кафедра гистологии в Питербургской Медико-хирургической академии. К этой школе относятся К.Э.Бэр - эмбриолог, НМ Якубович - заслуги при изучении ЦНС, МД Лавдовский - автор первого учебника по гистологии.
Ковалевский АО - один из основоположников сравнительной эмбриологии, экспериментальной и эволюционной гистологии; установил единый план развития многоклеточных; обосновал теорию зародышевых листков, как образований лежащих в основе единства развития всех млекопитающих.
Основатель кафедры гистологии в Киевском универ-те - ПИ Перемежко (1968). Киевская школа достигла успехов при изучении развития зародышевых листков, закладки и развития многих органов.
Родоначальник Казанской школы - ИА Арнштейн - занимались проблемой нейрогистологии.
Говоря о вкладе отечественных исследователей в гистологию в советский период нужно отметить:
1. Академик АА Заварзин - предложил теорию «параллельных рядов в тканевой эволюции» - эволюция тканей у разных типов и классов животных происходит сходно, параллельными рядами, поэтому у разных животных ткани с родственными функциями имеют сходное строение.
2. НГ Хлопин - создал теорию «дивергентной эволюции тканей» - ткани развиваются в эволюции и онтогенезе дивергентно, путем расхождения признаков. Поэтому в каждой из 4-х основных группах тканей предлагается выделить подгруппы или типы тканей по их происхождению, источнику развития.
Кафедра гистологии БГМУ создана в 1934 году под руководством профессора Николая Илларионовича Чурбанова. Сотрудники кафедры занимались изучением нейроэндокринного аппарата пищеварительной системы, разработкой гематологических нормативов для различных возрастных групп населения республики Башкортостан, влиянием производственных факторов на организм матери и плода в системе мать:плод, проблемой регенерации мышечных тканей.
4.Гистология и эмбриология и их связь с медико-биологическими дисциплинами.
Гистология с цитологией и эмбриологией, как и другие биологические науки, решает главную задачу - выяснение источников развития, закономерностей гистогенеза, реактивности и регенерации тканей и в связи с этим - возможность целенаправленного воздействия на них. Среди теоретических положений гистологии важное место занимают клеточная теория, теория зародышевых листков, эволюции тканей, гистогенеза и регенерации.
Современные гистология, цитология и эмбриология вносят существенный вклад в разработку теоретических и прикладных аспектов современной медицины и биологии.
К фундаментальным теоретическим проблемам относятся:
Разработка общей теории гистологии, отражающей эволюционную динамику тканей и закономерности эмбрионального и постнатального гистогенеза;
Изучение гистогенеза как комплекса координированных во времени и пространстве процессов пролиферации, дифференциации, детерминации, интеграции, адаптивной изменчивости, программированной гибели клеток и др.;
Выяснение механизмов тканевой регуляции (нервной, эндокринной, иммунной), а также возрастных изменений тканей;
Изучение закономерностей реактивности и адаптивной изменчивости клеток и тканей при действии неблагоприятных экологических факторов и в экстремальных условиях функционирования и развития, а также при трансплантации;
Разработка проблемы регенерации тканей после повреждающих воздействий и методов тканевой заместительной терапии;
Раскрытие механизмов молекулярно-генетической регуляции клеточной дифференцировки, наследования генетического дефекта развития систем человека, разработка методов генной терапии и трансплантации стволовых эмбриональных клеток;
Выяснение процессов эмбрионального развития человека, критических периодов развития, воспроизводства и причин бесплодия.
Курс гистологии с цитологией и эмбриологией тесно связан с преподаванием других медико-биологических наук - биологии, анатомии, физиологии, биохимии, патологической анатомии, а также клинических дисциплин. Так, раскрытие основных закономерностей структурной организации клеток является основой для изложения вопросов генетики в курсе биологии. С другой стороны, изложение вопросов, касающихся эволюции живой материи, в курсе биологии является необходимой предпосылкой для изучения различных уровней организации живой материи в организме человека. Изучение строения органов в курсе анатомии базируется на данных гистологического анализа. В настоящее время, когда исследования клеточных и тканевых структур ведутся на субклеточном и молекулярном уровнях с применением биохимических, иммуноцитохимических методов, отмечается особенно тесная связь гистологии, цитологии и эмбриологии с биохимией и молекулярной биологией. В преподавании, научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли цито- и гистохимические данные. Знание нормальной структуры клеток, тканей и органов является необходимым условием для понимания механизмов их изменений в патологических условиях, поэтому гистология с цитологией и эмбриологией тесно связана с патологической анатомией и многими клиническими дисциплинами (внутренние болезни, акушерство и гинекология и др.). Таким образом, гистология с цитологией и эмбриологией занимает важное место в системе медицинского образования. Для современной медицины с ее направленностью на предупреждение и раннее выявление патологических процессов в организме знания о структурных основах и закономерностях обеспечения устойчивости и надежности живых систем (в том числе - тканей) особенно важны, поскольку прогрессивное развитие цивилизации неизбежно влечет за собой появление новых факторов, неблагоприятно воздействующих на животные организмы, в том числе и человека.
Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования - микроскопирование.
Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.
Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.
Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.
Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:
Микроскопирование.
Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.
Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.
Ультрафиолетовая микроскопия . Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.
Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.
Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.
Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.
Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка . Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.
Методы качественных и количественных исследований.
Гисто – и цитохимия , в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.
Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.
Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.
Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.
Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр - и объект-микрометров и специальных сеток.
Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.
Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток. С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.
Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.
Метод трансплантации тканей . Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.
Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.