Веретено представляет собой комплекс, состоящий из микротрубочек и связанных с ними моторных белков. Организация микротрубочек обладает высоким уровнем поляризации
Микротрубочки веретена представляют собой очень динамичную структуру. Одни проявляют динамическую нестабильность, для других характерна текучесть субъединиц
Сила, необходимая для сборки веретена, генерируется при взаимодействии микротрубочек с моторными белками
Образование и функционирование веретена зависят от динамических свойств микротрубочек и от работы связанных с ними белковых моторов. Хотя микротрубочки образуют основные структурные элементы веретена, их организация и движение хромосом обеспечиваются белковыми моторами. Одни моторы непосредственно участвуют в сборке веретена и в связывании его компонентов в определенную структуру, а другие обеспечивают присоединение хромосом к веретену и генерируют силу, необходимую для их перемещения.
Несмотря на то что традиционно веретено рассматривается как структура, состоящая из микротрубочек , правильнее считать ее комплексом микротрубочек, белковых моторов и других белков.
Хотя моторы играют существенную роль в генерации силы, необходимой для функционирования веретена , микротрубочки представляют собой нечто большее, чем просто неподвижную структуру, вдоль которой они движутся. Во время митоза микротрубочки ведут себя как высокодинамичная структура, и это их свойство играет важную роль при сборке веретена и расхождении хромосом.
В веретене микротрубочки организованы в соответствии со своей полярностью.Все минус-концы локализованы, поблизости от одной из двух центросом, а плюс-концы расположены на расстоянии от них.
В центре веретена микротрубочки от двух центросом перекрываются,
что обеспечивает расположение микротрубочек противоположной полярности (антипараллельные микротрубочки) близко друг к другу.
В пределах веретена микротрубочки организованы в соответствии с полярностью. Два конца микротрубочки различаются по составу и структуре. Это обусловливает ее структурную «полярность»; микротрубочка как бы указывает то или иное направление. В каждом полуверетене и связанной с ним звезде микротрубочки расположены с одинаковой полярностью: их минус-концы находятся на полюсах, а плюс-концы, на некотором от них расстояниии.
В месте пересечения двух поляризованных пучков микротрубочки перекрываются, создавая область в центре веретена, в которой соседние микротрубочки имеют противоположную полярность. Одинаковая ориентация микротрубочек в каждом полуверетене необходима для нормального функционирования их моторов при делении. Если бы полярность микротрубочек в пределах каждого полуверетена была произвольной, то молекулы каждого типа моторов просто мешали бы друг другу, делая движение хаотичным или просто невозможным.
Динамические свойства микротрубочек играют важную роль во всех фазах . Исследования, проведенные на культуре клеток позвоночных и с использованием экстрактов из яйцеклеток лягушки Xenopus laevis, показали, что в каждом веретене микротрубочки характеризуются динамической нестабильностью и являются более короткими и гораздо более динамичными, чем в интерфазных клетках. Некоторые различия можно объяснить возрастанием частоты катастроф в митозе, когда плюс-концы микротрубочек из состояния роста или полимеризации переходят в состояние укорочения или разрушения. Частично это также объясняется снижением частоты наступления спасений, при которых процесс деполимеризации или укорочения микротрубочек обратно переходит в процесс их полимеризации или роста.
Это усиление динамики происходит в клетках, вступающих в митоз, поскольку белки, связанные с микротрубочками и обычно препятствующие катастрофе, заингибированы, в то время как другие, стимулирующие рост микротрубочек, активируются. Баланс между двумя противоположно направленными процессами поддерживается основной киназой, регулирующей митоз, комплексом циклин B/CDK1, которая активируется во время разрушения ядерной оболочки. Как будет показано ниже, усиление динамики микротрубочек в клетках, вступающих в митоз, играет основную роль в сборке веретена.
После образования веретена начинает проявляться еще один тип динамики микротрубочек. В это время микротрубочки обнаруживают текучесть субъединиц. Это интересное явление заключается в том, что субъединицы тубулина присоединяются к плюс-концу микротрубочки и затем продвигаются по ней к минус-концу, на котором высвобождаются. Как следует из рисунков ниже, текучесть характерна для всех микротрубочек веретена, однако особенно она проявляется у микротрубочек нитей кинетохора. Происхождение этого явления не вполне понятно, но, возможно, оно связано с взаимодействием плюс- и минус-концов микротрубочек веретена с другими его компонентами (например, с белковыми моторами). Даже в то время, когда у микротрубочек веретена наблюдается текучесть, астральные микротрубочки продолжают проявлять динамическую нестабильность.
Хотя значение явления текучести неизвестно, возможно, оно играет роль в перемещении хромосом и в поддержании баланса сил в веретене, с тем чтобы две его половины оставались расположенными симметрично.
С системой микротрубочек взаимодействуют много различных типов белковых моторов . В митозе участвует цитоплазматический мотор динеин, осуществляющий транспорт к минус-концу, и моторы группы кинезинов (большая часть которых движется в направлении плюс-конца). Веретено имеет сложную организацию, и моторы настолько тесно связаны с его формированием и функцией, что только в делении клеток высших организмов участвует более 15 представителей семейства кинезинов.
Белковые моторы расположены по всему веретену. Они находятся на кинетохорах, на плече хромосом, на полюсах и на микротрубочках между полюсами и хромосомами. Многие типы моторов располагаются только в определенных местах, другие занимают несколько мест. Например, цитоплазматический динеин обнаружен в кинетохорах и на полюсах, а также в клеточном кортексе, где он взаимодействует с астральными микротрубочками. В то же время кинезин-подобный белковый мотор CENP-E находится в кинетохоре, а хромокинезины только на плечах хромосом.
В митозе белковые моторы выполняют несколько основных функций. Одни из них, например динеин, связываются со структурами, включая кинетохоры и плазматическую мембрану, и транспортируют их вдоль микротрубочки (хотя в случае плазматической мембраны движется микротрубочка). Другие имеют множественные домены, организованные таким образом, что мотор может связываться сразу с двумя микротрубочками, и скреплять их между собой. В зависимости от структуры моторов микротрубочки в пучке могут обладать той же самой или противоположной полярностью. Если мотор связывается с микротрубочками противоположной полярности, он будет пытаться двигаться (скользить) по ним до тех пор, пока они перекрываются. Примером такого типа моторов является представитель кинезинов Eg5, который может связываться с обоими концами антипараллельных микротрубочек.
Наоборот, если мотор устроен так, что он связан с двумя микротрубочками с одинаковой полярностью, то в результате образуется структура с такой же полярностью, расположенная таким образом, что микротрубочки образуют фигуру, напоминающую звезду. Прочие кинезин-подобные белки не перемещаются по микротрубочкам, а способствуют разборке их плюс-концов. Наглядным примером такого белка является кинезин, связанный с митотической центромерой (МСАК), который находится на центромере каждой хромосомы. В состав веретена входят моторы с перечисленными выше основными свойствами, которые определенным образом расположены относительно друг друга. Эти же моторы генерируют усилия для движения хромосом.
Не всегда ясно, каким образом моторы обеспечивают функционирование веретена . В ряде случаев, например, они располагаются таким образом, что могут мешать друг другу. Однако, независимо от деталей строения веретена, очевидно, что его образования и функционирования необходимы множественные сбалансированные усилия. Эти усилия обеспечиваются моторами, которые расположены на каркасе динамических микротрубочек веретена.
Субъединицы тубулина постоянно включаются в микротрубочки со стороны кинетохоров и продвигаются к полюсам, где происходит их высвобождение.
Таким образом, они постоянно мигрируют от кинетохоров к полюсам вдоль микротрубочек нити кинетохора.
В течение метафазы длина кинетохорной микротрубочки остается постоянной, пока скорость сборки субъединиц на плюс-конце соответствует их разборке на минус-конце.
Если сборка субъединиц со стороны кинетохора снижается, а на полюсе скорость их разборки не изменяется, то кинетохор будет двигаться к полюсу.
Таким образом, текучесть субъединиц микротрубочек представляет собой возможный способ движения хромосомы.
Первый видеокадр, на котором представлено митотическое веретено клетки, часть тубулина которого содержит флуоресцирующий зонд (флуоресцирует зеленым).
Кинетохоры выделены оранжевыми стрелками. На видео показан поток зеленых точек кинетохорной нити во всем веретене.
В образовании веретена участвуют молекулярные моторы, которые перемещаются по микротрубочкам.
Веретено формируется за счет специфических взаимодействий между этими моторами и микротрубочками.
Эти взаимодействия обеспечивают также его подвижность и являются источниками силы.
Стрелками указано направление движения моторов.
Хромосомы разделяются посредством митотического веретена
Веретено представляет собой симметричную биполярную структуру, состоящую из микротрубочек, расположенных между двумя полюсами. На каждом полюсе находится центросома
Центросомы прикрепляются к веретену за счет взаимодействия своих кинетохоров с
Веретено представляет собой сложную динамическую структуру, которая быстро образуется в начале процесса деления и при его окончании так же быстро разрушается. Веретено необходимо для митоза и служит для выполнения двух отдельных функций: (1) обеспечение разделения реплицированных хромосом по дочерним ядрам при делении ядра (кариокинез) и (2) управление процессом деления цитоплазмы (цитокинез).
Если заблокировать образование веретена (например, обработав клетки различными химическими соединениями), то хромосомы конденсируются, но не движутся, как это обычно происходит в митозе, и процесс деления останавливается. Во многом веретено представляет собой род биологического мотора, который превращает химическую энергию в механическую работу, необходимую для перемещения хромосом и деления клетки. Функции веретена отражаются в его строении. Симметричная структура с двумя полюсами необходима для успешного прохождения митоза.
Действительно, она отражает принцип парности клеточного деления , при котором одна клетка и реплицированная ДНК делятся на две отдельных дочерних клетки.
Метафазное веретено в живой клетке тритона, видимое в фазовоконтрастном и поляризационном микроскопе.Показана часть такой же клетки с веретеном в той же ориентации после иммунофлуоресцентного окрашивания микротрубочек (зеленым), хромосом (синим) и кератиновых филаментов (красным).
Отметим, что веретено не видно в фазовом контрасте, но видно в поляризованном свете. Микротрубочки веретена наиболее отчетливо видны после иммунофлуоресцентного окрашивания.
Веретено можно увидеть с помощью различных методов. Основной структурный элемент веретена - микротрубочки, слишком малы для того, чтобы их можно было видеть с помощью светового микроскопа (т. е. из-за недостаточного разрешения). Поэтому, хотя в клетках высших организмов часто можно наблюдать с помощью обычного светового микроскопа конденсированные хромосомы, веретена при этом не видно. Однако во многих случаях можно сделать вывод о наличии веретена по косвенному признаку, поскольку эта структура вытесняет видимые клеточные органеллы. При этом, как показано на рисунке ниже, пространство, занимаемое веретеном, по сравнению с окружающей цитоплазмой кажется более прозрачным. Хотя вначале исследователи считали, что веретено состоит из волокон, до начала 1950-х гг. это предположение не было подтверждено прямыми наблюдениями.
К этому времени усовершенствования техники поляризационной световой микроскопии позволили увидеть веретено на препаратах клеток. Типичная фотография веретена, полученная с помощью светового микроскопа, представлена на рисунке ниже. Структура приобрела черную окраску из-за взаимодействия поляризованного света с микротрубочками. В течение 1970-х гг. была разработана техника с использованием флуоресцентных зондов, которая позволила наблюдать компоненты веретена в трехмерном пространстве даже в живой клетке. Эта техника позволяет прослеживать положения одного или нескольких специфических белков веретена в ходе митоза. Одним из таких белков почти всегда является тубулин, поскольку он обеспечивает визуализацию микротрубочек.
При наблюдении в электронном микроскопе веретено типичной клетки млекопитающих состоит из трех структурных компонентов. Как показано на рисунке ниже, в каждом из двух полярных участков находится центросома. Эта красивая органелла включает пару небольших, интенсивно окрашенных структур, называемых центриолями.
Они окружены более или менее плотным диффузным материалом . Между центросомами расположены хромосомы, которые в большинстве клеток являются самыми крупными структурами веретена. Хромосомы состоят из компактных, плотно скрученных и сильно базофильных фибрилл хроматина диаметром 25 нм. Каждая хромосома содержит две небольших структуры, называемых кинетохоры (от греч. kineto - подвижный; chora - пространство). Кинетохоры прикрепляются к противоположным сторонам своей центромеры. Между полюсами веретена проходит плотный пучок расположенных параллельно друг другу микротрубочек.
На рисунке ниже это видно наиболее отчетливо. Один из концов микротрубочек веретена обычно расположен на самом полюсе или рядом с ним. Другой находится в области веретена в свободном состоянии или связан с кинетохором. Микротрубочки растут от каждого полюса, что делает веретено симметричной структурой, образованной двумя параллельными и перекрывающимися пучками микротрубочек. Каждый из этих пучков называется полуверетено. У большинства позвоночных полуверетено состоит из 600-750 микротрубочек, 30-40% которых заканчиваются на кинетохорах.
В каждом полуверетене , наряду с основными микротрубочками, из каждого полюса выходят другие микротрубочки. Эти микротрубочки распространяются во всех направлениях, образуя радиальные структуры, которые называются звездами (астерами) и располагаются в центре каждого полюса. Так же как и микротрубочки веретена, все астральные микротрубочки одним концом ориентированы на полюс, а другим на отдаленную точку в цитоплазме. В митозе астральные звезды обладают несколькими функциями. Наряду с позиционированием веретена в клетке, которое определяет плоскость цитокинеза, они также участвуют в отделении полюсов (центросом) при образовании веретена в анафазе В.
Критическую роль в митозе также играют два кинетохора каждой хромосомы. Их роль в перемещении хромосом обнаружилась очень давно, поскольку оказалось, что фрагменты хромосом, не содержащие кинетохора, не способны к направленному движению. Особенно важно, каким образом располагаются кинетохоры по отношению друг к другу. Поскольку они расположены на противоположных сторонах центромеры, то обращены к противоположным полюсам веретена, что позволяет реплицированным хромосомам присоединяться к обоим полюсам. Наличие такой позиционной взаимосвязи между двумя кинетохорами существенно для сегрегации двух хроматид в разные ядра. При образовании веретена каждый кинетохор связывается с концами множества микротрубочек, исходящих из одного полюса, и образует пучок, называемый кинетохорным пучком, который проходит между кинетохором и полюсом.
И сами кинетохоры не являются всего лишь транспортной системой канатов, позволяющих хроматидам продвигаться к полюсам. Скорее всего, они играют более важную активную роль, не только определяя направление движения хромосомы, но и генерируя усилия, необходимые для этого движения.
Для того чтобы понять молекулярные механизмы митоза , необходимо ответить на следующие кардинальные вопросы. Каким образом формируется веретено и как обеспечивается его биполярная структура? Каким образом генерируются усилия, обеспечивающие движение хромосом и как это движение регулируется? Как обеспечивается точность процесса сегрегации хромосом? Каким образом после сегрегации хромосом происходит разделение цитоплазмы с образованием двух дочерних клеток?
Электронная микрофотография, демонстрирующая основные структурные элементы митотического веретена.
Крупные пучки микротрубочек соединяют каждую центросому с кинетохорами на хромосомах.
В центре фотографии кинетохоры, помеченные стрелками, иллюстрируют, что два кинетохора на хромосоме обращены к противоположным полюсам веретена.
На основной фотографии помещено изображение центросомы в электронном микросокопе.
Две центриоли расположены под прямым углом друг к другу, так, что одна выглядит как круг, а другая как прямоугольник.
Вокруг первой центриоли находится скопление гранулярного материала
(сравните область, примыкающую к центриоли, с более удаленными частями цитоплазмы,
которые окрашены менее интенсивно и где заметно присутствие многих мембранных везикул).
Нити кинетохора, прикрепленные к сестринским хроматидам.
Окрашивание иммунофлуоресцентным методом (слева) и фотография, сделанная в электронном микроскопе (в центре и справа).
Последовательность событий мейоза включает два клеточных деления.
При первом делении происходит разделение гомологичных хромосом,
при втором разделяются индивидуальные хроматиды (каждой хромосомы).
При митозе происходит только разделение хроматид.
7. Аппарат клеточного деления
8. Фазы митоза
9. Патология митоза
Деление всех эукариотических клеток сопряжено с формированием специального аппарата клеточного деления. Активная роль в митотическом делении клеток зачастую отведена цитоскелетным структурам. Универсальным как для животных, так и для растительных клеток является двухполюсное митотическое веретено, состоящее из микротрубочек и связанных с ними белков. Веретено деления обеспечивает строго одинаковое распределение хромосом между полюсами деления, в области которых в телофазе образуются ядра дочерних клеток.
Ещё одна не менее важная структура цитоскелета отвечает за разделение цитоплазмы и, как следствие, за распределение клеточных органелл. В животных клетках за цитокинез отвечает сократимое кольцо из актиновых и миозиновых филаментов. В большинстве клеток высших растений из-за наличия жёсткой клеточной стенки цитокинез протекает с образованием клеточной пластинки в плоскости между двумя дочерними клетками. При этом область образования новой клеточной перегородки определяется заранее предпрофазным пояском из актиновых микрофиламентов, а поскольку актин участвует также в формировании клеточных септ у грибов, возможно, что он направляет цитокинез у всех эукариот.
Веретено деления
Поздняя метафаза митоза в клетке лёгкого тритона. Четко просматривается веретено деления, образованное микротрубочками, и хромосомы
Формирование веретена деления начинается в профазе. В его образовании принимают участие полярные тельца веретена и кинетохоры хромосом, и те и другие взаимодействуют с микротрубочками биополимерами, состоящими из субъединиц тубулина. Главным центром организации микротрубочек во многих эукариотических клетках является центросома скопление аморфного фибриллярного материала, причём в большинстве животных клеток в состав центросом также входят пары центриолей. Во время интерфазы ЦОМТ, как правило, располагающийся вблизи клеточного ядра, инициирует рост микротрубочек, расходящихся к периметру клетки и образующих цитоскелет. В S-фазе материал центросомы удваивается, а в профазе митоза начинается расхождение дочерних центросом. От них в свою очередь «отрастают» микротрубочки, которые удлиняются вплоть до соприкосновения друг с другом, после чего центросомы расходятся. Затем, в прометафазе, после разрушения ядерной мембраны, микротрубочки проникают в область клеточного ядра и взаимодействуют с хромосомами. Две дочерние центросомы теперь называют полюсами веретена.
По морфологии различают два типа митотического веретена: астральный и анастральный.
Астральный тип митотической фигуры, характерный для животных клеток, отличают благодаря небольшим зонам, на полюсах веретена, в которых сходятся микротрубочки. Зачастую центросомы, располагающиеся в области полюсов астрального веретена, содержат центриоли. От полюсов деления также расходятся во всех направлениях радиальные микротрубочки, не входящие в состав веретена, а образующие звездчатые зоны цитастеры.
Анастральный тип митотической фигуры отличается широкими полярными областями веретена, так называемыми полярными шапочками, в их состав не входят центриоли. Микротрубочки при этом расходятся широким фронтом от всей зоны полярных шапочек. Этот тип митотической фигуры также отличает отсутствие цитастеров. Анастральный тип митотического веретена наиболее характерен для делящихся клеток высших растений, хотя иногда наблюдается и в некоторых клетках животных.
Микротрубочки
Микротрубочки динамичные структуры, принимающие активное участие в построении веретена деления во время митоза. Химически они представляют собой биополимеры, состоящие из субъединиц белка тубулина. Количество микротрубочек в клетках различных организмов может значительно отличаться. В метафазе веретено деления в клетках высших животных и растений может содержать до нескольких тысяч микротрубочек, тогда как у некоторых грибов их всего около 40.
Митотические микротрубочки веретена деления «динамически нестабильны». Их «положительные» или «плюс-концы», расходящиеся во всех направлениях от центросом резко переходят от равномерного роста к стремительному укорочению, при котором часто деполимеризуется вся микротрубочка. Согласно этим данным образование митотического веретена объясняется селективной стабилизацией микротрубочек взаимодействующих в экваториальной области клетки с кинетохорами хромосом и с микротрубочками, идущими от противоположного полюса деления. Данная модель объясняет характерную двухполюсную фигуру митотического веретена.
Центромеры и кинетохоры
Центромеры специализированные последовательности ДНК, необходимые для связывания с микротрубочками веретена деления и для последующего расхождения хромосом. В зависимости от локализации различают несколько типов центромер. Для голоцентрических центромер характерно образование связей с микротрубочками веретена по всей длине хромосомы. В противоположность голоцентрическим моноцентрические центромеры служат для связи с микротрубочками в единственной области хромосомы.
В центромерной области обычно располагаются кинетохоры хромосом сложные белковые комплексы, морфологически очень сходные по своей структуре для различных групп эукариот, как, например, для диатомовых водорослей, так и для человека. Обычно на каждую хроматиду приходится по одному кинетохору. На электронных микрофотографиях кинетохор обычно выглядит как пластинчатая трехслойная структура. Порядок слоев следующий: внутренний плотный слой, примыкающий к телу хромосомы; средний рыхлый слой; внешний плотный слой, от которого отходит множество фибрилл, образуя т. н. фиброзную корону кинетохора.
К основным функциям кинетохора относят: закрепление микротрубочек веретена деления, обеспечение движения хромосом во время митоза при участии микротрубочек, связывание между собой сестринских хроматид и регуляцию их последующего разделения в анафазе митоза. Минимально достаточно одной микротрубочки ассоциированной с кинетохором, чтобы обеспечить движение хромосомы. Однако с одним кинетохором могут быть связаны целые пучки, состоящие из 20-40 микротрубочек, чтобы обеспечить расхождение хромосом к полюсам клетки.
| Прево, Жан-Луи |
И деления клетки. Типичное веретено является биполярным - между двумя полюсами образуется веретенообразная система микротрубочек. Микротрубочки веретена присоединяются к кинетохорам хроматид в области центромер и обеспечивают движение хромосом по направлению к полюсам.
Веретено образуют три основных структурных элемента: микротрубочки, полюса деления и хромосомы. В организации полюсов деления у животных участвуют центросомы , содержащие центриоли . У растений , а также в ооцитах некоторых животных центросомы отсутствуют, и образуется ацентросомальное веретено с широкими полюсами. Важную роль в формировании веретена играют моторные белки , относящиеся к семействам динеинов и кинезинов .
Полноценное веретено деления образуется на стадии прометафазы после разрушения ядерной мембраны , когда цитоплазматические микротрубочки и центросомы (у животных) получают доступ к хромосомам и другим компонентам веретена. Исключение составляет веретено деления почкующихся дрожжей , которое формируется внутри ядра.
Структура
Веретено деления типичной клетки млекопитающих состоит из трёх структурных элементов - центросом , микротрубочек и хромосом , - которые образуют симметричную биполярную структуру. На полюсах веретена располагаются центросомы - небольшие органеллы, функционирующие как центры организации микротрубочек . Каждая центросома состоит из пары центриолей , окруженных множеством разных белков. Между полюсами веретена находятся конденсированные хромосомы, состоящие из пары хроматид , скреплённых в области центромеры . На центромерных участках хромосом находятся кинетохоры - сложные структуры, отвечающие за прикрепление к микротрубочкам веретена .
Веретено деления состоит из двух полуверетён. Полуверетено образуется из поляризованных микротрубочек. Отрицательные минус-концы микротрубочек собираются на полюсах веретена вокруг центросом. Плюс-концы микротрубочек отдаляются от двух полюсов и пересекаются в средней экваториальной части веретена. У большинства позвоночных полуверетено состоит из 600-750 микротрубочек, 30-40 % которых заканчиваются на кинетохорах. Микротрубочки, которые соединяют полюса веретена с кинетохорами хромосом, называются кинетохорными . Причём каждый кинетохор при образовании веретена связывается с множеством микротрубочек и образует кинетохорный пучок. Микротрубочки, которые располагаются между полюсами и не присоединяются к кинетохорам, называются межполюсными . Часть микротрубочек веретена образует вокруг каждого полюса радиальные структуры, называемые звёздами или астерами. Такие микротрубочки называются астральными .
У растений, а также в ооцитах некоторых животных центросомы отсутствуют, и образуется ацентросомальное веретено с широкими полюсами . Также на полюсах ацентросомального веретена отсутствуют астральные микротрубочки. В остальном структура веретена растительной клетки соответствует структуре веретена животной клетки.
Сборка веретена деления
Начало сборки веретена в профазе
Сборка веретена деления начинается в профазе. Однако на данном этапе образование полноценного веретена невозможно по причине изоляции хромосом, а также важных моторных, регуляторных и стабилизирующих белков внутри ядра.
У растений, по причине отсутствия центросом, роль центра организации микротрубочек в профазе выполняет ядерная оболочка. Микротрубочки собираются вблизи поверхности ядра и к окончанию профазы ориентируются вдоль оси будущего веретена деления, образуя так называемое профазное веретено .
В животных клетках центром организации микротрубочек является центросома. Поэтому образование веретена деления начинается с разделения и расхождения пары центросом во время профазы. Расхождение центросом в профазе обеспечивают моторные белки динеины . Они закрепляются на внутренней стороне клеточной мембраны и на внешней поверхности ядра. Закреплённые в мембране динеины присоединяются к астральным микротрубочкам и движутся в направлении минус-конца микротрубочки. За счёт этого центросомы перемещаются к противоположным участкам клеточной мембраны и расходятся дальше друг от друга .
Сборка веретена в прометафазе
Самоорганизация веретена:
Исключение составляет веретено деления почкующихся дрожжей, которое формируется внутри ядра .
Самоорганизация веретена
У всех эукариот сборка биполярного веретена деления зависит по большей части от способности компонентов веретена к самоорганизации. Самоорганизация - единственный механизм сборки веретена деления в клетках лишённых центросом . Сборка биполярного веретена без участия центросом называется ацентросомальной. Она характерна для высших растений, а также наблюдается при мейозе на ранних стадиях развития некоторых животных. Более того, предполагается, что самоорганизация микротрубочек является преобладающим механизмом сборки веретена, даже в животных клетках, содержащих центросомы.
Самоорганизация веретена начинается после разрушения ядерной мембраны. Цитоплазматические микротрубочки собираются (нуклеируются) вокруг хромосом. Здесь при участии локальных стабилизирующих факторов происходит удлинение накапливающихся микротрубочек. Далее начинается организация микротрубочек с участием трёх групп моторных белков :
- Моторные белки семейства кинезин-5 (Eg5) связываются с двумя противоположно ориентированными микротрубочками и одновременно движутся в направлении плюс-конца каждой из них. В итоге происходит сортировка антипараллельных поляризованных микротрубочек и их «сшивка» в районе плюс-конца.
- Хромокинезины - белковые моторы семейства кинезин-4 и -10, локализованные на плечах хромосом, - связывают микротрубочки находящиеся вблизи хромосом и перемещаются в направлении плюс-конца микротрубочки. Тем самым плечо хромосомы оказывается связано с плюс-концом микротрубочки, а минус-конец оказывается дистанцирован от хромосомы.
- Третья группа моторных белков перемещается в направлении минус-концов микротрубочек и обеспечивает связку минус-концов на полюсах веретена. К данной группе моторов относятся цитоплазматические динеины , кинезин-14. Динеин участвует в фокусировке полюсов деления совместно с многочисленными ядерными белками, например NuMA1 (англ. Nu clear M icrotubule-A ssociated protein 1).
Сборка с участием центросом
Во многих животных клетках, включая человеческие, в сборке веретена участвуют центросомы, являющиеся полюсами веретена деления. Также как и при сборке ацентросомального веретена, моторные и другие белки участвуют в самоорганизации микротрубочек в биполярную структуру, которая фокусируется с помощью минус-концов микротрубочек в области центросом. Центросомы при этом тоже участвуют в сборке веретена и способствуют формированию полюсов деления, но не являются неотъемлемым компонентом веретена, так как процесс сборки может протекать даже при инактивации центросом .
В зависимости от времени расхождения центросом относительно момента разрушения ядерной оболочки выделяют два механизма образования веретена :
- Если ядерная оболочка разрушается до начала расхождения центросом, то высвободившиеся хромосомы распределяются по цитоплазме, и образуется «однополюсное» веретено с микротрубочками, расходящимися от спаренных центросом. Дальнейшее образование двухполюсного веретена происходит за счёт сил отталкивания перекрывающихся микротрубочек и под действием тянущих сил астральных микротрубочек. Отталкивающее усилие между перекрывающимися микротрубочками создаётся кинезиноподобными белками Eg5. Тянущие силы, приложенные к астральным микротрубочкам, создаются цитоплазматическими динеинами, закреплёнными на внутренней поверхности клеточной мембраны.
- Второй вариант сопряжён с расхождением центросом и образованием первичного веретена до разрушения ядерной оболочки. Первичное веретено образуется за счёт тянущих сил астральных микротрубочек, которые создаются цитоплазматическими динеинами, закреплёнными на внутренней поверхности клеточной мембраны и на поверхности ядерной оболочки. Направление расхождения центросом задаётся актиновыми филаментами, которые взаимодействуют с миозином , расположенным в самих центросомах или вдоль микротрубочек. Первичное веретено является нестабильным. Для его устойчивости необходимо взаимодействие с кинетохорами хромосом и другими белками, находящимися внутри клеточного ядра.
Присоединение хромосом к веретену
Наиболее изучен механизм присоединения хромосом к веретену в животных клетках содержащих центросомы. Во время профазы вокруг центросом формируется звёздчатая структура из микротрубочек, расходящихся в радиальном направлении. Область ядра после разрушения ядерной мембраны активно зондируется динамически нестабильными микротрубочками, которые захватываются кинетохорами хромосом. Часть хромосом быстро связывается с микротрубочками от противоположных полюсов. Другая часть хромосом сначала присоединяется к микротрубочкам исходящим от одного из полюсов. После чего перемещается в направлении соответствующего полюса. Затем связанные с одним полюсом хромосомы захватывают микротрубочки от противоположного полюса. В процессе метафазы к каждому кинетохору присоединяется порядка 10-40 микротрубочек, которые образуют кинетохорный пучок. Все хромосомы оказываются связанными с противоположными полюсами деления и собираются в метафазную пластинку в центре веретена .
Существует также альтернативная модель присоединения кинетохоров к веретену, подходящая как для клеток с центросомами, так и для клеток лишённых центросом. Согласно этой модели вблизи хромосом происходит нуклеация коротких микротрубочек при участии гамма-тубулинового кольцевого комплекса. Своим плюс-концом микротрубочки встраиваются в кинетохоры. Вслед за этим происходит регулируемый рост (полимеризация) микротрубочек. Удлиняющиеся минус-концы микротрубочек «сшиваются» и фокусируются в области полюсов деления при участии моторных белков. Центросомы (в случае их наличия) способствуют присоединению кинетохорных микротрубочек к полюсам деления .
Биполярная ориентация сестринских хроматид
Для равного распределения хромосом между дочерними клетками, важно, чтобы кинетохоры парных хроматид были присоединены к микротрубочкам, исходящим от противоположных полюсов. Нормальное биполярное прикрепление кинетохоров к противоположным полюсам называется амфителическим . Однако в процессе сборки веретена могут возникать иные прикрепления хромосом. Присоединение одного кинетохора к одному полюсу деления называется монотелическим . Присоединение сразу двух кинетохоров одной хромосомы к одному полюсу деления называется синтелическим . Возможно также и меротелическое прикрепление, при котором один кинетохор соединяется сразу с двумя полюсами .
Неверное присоединение отчасти предотвращается за счёт самой геометрии сестринских кинетохоров, которые находятся на противоположных сторонах центромерной области хромосом. К тому же неправильные прикрепления являются нестабильными и обратимыми, а нормальное биполярное крепление кинетохоров является стабильным. Стабильное соединение достигается за счёт сил натяжения, исходящих от противоположных полюсов деления. Основным компонентом регуляторной системы, ответственной за правильное присоединение кинетохоров к противоположным полюсам, является протеинкиназа ISBN 978-0-9539181-2-6 .
2n-->S-->4n-->2x2n
ПРОФАЗА.
В профазе происходят следующие события: конденсация хромосом, формирование веретена деления, распад ядрышек, эндоплазматического ретикулума (ЭР), цитоплазматических микротрубочек, снижается и прекращается синтез РНК.
Каждая хромосома двойная (2x2n), они тесно соприкасаются и спирализуются одна относительно другой.
Конденсация хроматина.
После S-фазы сестринские хроматиды остаются связаны мультибелковым комплексом когезинов располагающимся вдоль хроматид в процессе их удвоения. Когезины удерживают хроматиды вместе вплоть до их расхождения в анафазе.
Первый признак Митоза – конденсация хромосом (у человека в 50 раз). Конденсины – белки участвующие в конденсации. Запуск M-Cdk фосфорилирования конденсинов отвечает за их сборку в комплексы на ДНК и конденсации хромосом. При конденсации затрачивается энергия АТФ. Хромосомы конденсируются вокруг продольной центральной оси хромосомы на которой наблюдается наибольшая концентрация конденсинов. В фиксированных препаратах наблюдается сначала спиральная укладка конденсинов вдоль хромосомы (рис.1)
рис.1 Спиральная укладка хроматид - окраска на специфические белки показывает их спиральное расположение в хромосомах.
Конденсины и когезины структурно родственны и работают по одинаковым механизмам. Установлено, что если после S-фазы соединение хроматид не наступило правильно, то конденсация также не наступает.
Конденсины (когезины) образуют димеры антипараллельно направленные на концах которых находятся ДНК- и АТФ-связывающие домены, а на середине гибкий шарнир (рис.2).
Когезины связывают хромосомы еще в S-фазе.
Cohesin is a four-subunit protein complex, in which a heterodimer of SMC proteins, in this case SMC1/SMC3, associates with two other proteins, the Scc1/RAD21/Mcd1 and Scc3 proteins. In vertebrates there are two variants of Scc3, called SA1 and SA2.(Jessberger 2005)
SMC (The structural maintenance of chromosomes proteins) обнаружены в бактериях и археях. В отличии от эукариотических, представляют гомодимеры, кодируемые одним геном.
рис.3 Structure of cohesin and a possible mechanism by which it might hold sister chromatids together. (A) Smc1 (red) and Smc3 (blue) form intramolecular antiparallel coiled coils, which are organized by hinge or junction domains (triangles). Smc1/3 heterodimers are formed through heterotypic interactions between the Smc1 and Smc3 junction domains. The COOH terminus of Scc1 (green) binds to Smc1"s ABC-like ATPase head, whereas its NH2 terminus binds to Smc3"s head, creating a closed ring. Scc3 (yellow) binds to Scc1"s COOH-terminal half and does not make any direct stable contact with the Smc1/3 heterodimer. Scc1"s separase cleavage sites are marked by arrows. Cleavage at either site is sufficient to destroy cohesion. By analogy with bacterial SMC proteins, it is expected that ATP binds both the Smc1 and Smc3 heads, alters their conformation, and possibly brings them into close proximity. By altering Scc1"s association with Smc heads, ATP binding and/or hydrolysis could have a role in opening and/or closing cohesin"s ring. (B) Cohesin could hold sister DNA molecules together by trapping them both within the same ring. Cleavage of Scc1 by separase would open the ring, destroy coentrapment of sister DNAs, and cause dissociation of cohesin from chromatin. (C) Smc-containing complexes other than cohesin could also function via chromatid entrapment. Condensin, for example (black), could organize mitotic chromosomes by trapping supercoils. It and/or other related complexes could hold distant loci together (arrow) and thereby facilitate the function of long-range enhancers and silencers of transcription.
Образование веретена деления
В микротрубочках веретена ~10^8 молекул тубулина. Веретено нормально функционирует при разрушении центриолей лазером. Центром организации микротрубочек служит аморфное вещество центросомы.
Микротрубочки растут от центросом, белки диненины связывают перекрывающиеся микротрубочки, которые продолжают расти и расталкиваются кинезинами, при этом полюса расходятся. В это время микротрубочки с кинетохором не связываются.
Число микротрубочек прикрепленных к кинетохорам различно у разных видов – у некоторых грибов – 1микротрубочка, у человека - 20-40.
Остаточное тельце – фрагменты полюсных микротрубочек+плотный матрикс.
После начала митоза центросомы расходятся и каждая образует радиально симметричный центр организации микротрубочек (астра). Центросома расположена у ядра. Две астры двигаются к противоположным сторонам ядра для формирования двух полюсов веретена деления. Когда ядерная оболочка разрушается (прометафаза) веретено захватывает хромосомы. В клетках эмбрионов Xenopus центросома удваивается даже если ядро было передвинуто, или репликация ДНК подавлена. Центросомный цикл продолжается почти нормально: сначала 2, потом 4, 8 центросом и т.д. На ооцитах Xenopus было показано, что G1/S-Cdk (комплекс cyclin E и Cdk2) инициирует ДНК репликацию в S фазе также стимулирует удвоение центросомы, это предположительно объясняет почему удвоение центросом происходит в начале S-фазы
Рост веретена зависит от моторных белков принадлежащих к двум семействам – kinesin-related proteins движущиеся к ‘+’
концу и денеины, движущиеся к ‘–‘. Три типа микротрубочек наблюдаются в веретене – астральные, кинетохорные, перекрывающиеся-создают правильную структуру веретена. Микротрубочки растут от центросомы вперед ‘+’ концом. Три вида микротрубочек различаются поведением и наборами присоед белков.
Веретено начинает собираться в профазе. M-Cdk запускают фосфорилирование двух типов белков контролирующих динамику микротрубочек. Типы: моторные белки и microtubule-associated proteins (MAPs). Также имеются белки катастрофины.
В интерфазе микротрубочки отходят от одной центросомы и находятся в динамическом равновесии. Переключение ведущее к росту называется спасение, переключение к уменьшению микротрубочек – катастрофа. В профазе длинные интерфазные микротрубочки быстро преобразуются в множество коротких окружающих каждую центросому, которые начинают формировать веретено деления.
РАСПАД ЭР
ЭР распадается на мелкие вакуоли, лежащие по переферии клетки и Аппарата Гольджи (АГ), который теряет околоядерную локализацию, разделяется на отдельные диктиосомы разбросанные в цитоплазме.
ПРОМЕТАФАЗА
Распад ядерной оболочки, беспорядочное движение хромосом в области бывшего ядра, хромосомы через кинетохор соединяются с веретеном и начинают движение.
Распад ядерной оболочки
Кинетохор
Sc: кинетохор связан с цетромерным локусом CEN: CDEI,II,III. CDEI,III – консервативные районы сходны с Dm. CDEII – обогащен АТ, участок разной длины. CDE ответственен за связь с мт, взаимодействует с рядом белков.
кинетохор – мультибелковый комплекс, состоит из трех слоев:
наружный – плотный (СENP-E, СENP-F – участвуют в связывании мт), от него отходит множество фибрилл – фиброзная корона кинетохора (СENP-E, динеины)
средний – рыхлый, 3F3/2 – белок, регистрирует натяжение пучков мт
внутренний – плотный, участок ГХ обогащенный а-сателлитной ДНК (СENP-B- связывается с а-ДНК, MCAK-кинезинподобный белок-когезин, INCENP-когезин, СENP-А-аналог H3, СENP-G-связывается с белками ядерного матрикса, СENP-С-ф-ция не выяснена)
Функция кинетохора: связывание хроматид, закрепление мт веретена.
min число мт у Sc 1 на хромосому, у высших растений 20-40 мт на хромосому
белки кинетохора присутствуют во всех стадиях кц, образование и деление кх происх в S-периоде
Х-мы беспорядочно движутся – метакинез – то приближаются к полюсам, то удаляются к центру веретена, пока не займкт среднее положение – конгрессия х-м. мт случайно захватываются кинетохором и х-мы скользят по мт к полюсу 25мкм/мин, с помощью аналога динеина. Во время движения мт не разбираются. Хроматиды связаны и тянутся с двух сторон. Если лазером перерезать мт с одной стороны, то х-мы утянуться к противоположному полюсу
Перемещение хромосом к экватору
если митотич кл обработать D2O или таксолом – подавляют разборку мт?мт удлиняются и не тянут хромосомы?блок митоз
колхицин, низкая t, высокое гидростатич давление – разрушение нитей веретена?блок митоз
сила действующая на кинетохорную нить тем слабее чем ближе к полюсу нах кинетохор
МЕТАФАЗА
Завершается формирование веретена деления, хромосомы перестают двигаться и выстраиваются по экватору веретена (экваториальная пластинка)
метафаза - синтез белка – 20-30% от интерфазы. Клетки наиболее чувствительны к холоду, колхицину и др. агентам, которые разрушают веретено деления и приводят к прекращению митоза (К-митоз), при малых дозах митоз восстанавливается через несколько часов (иначе гибель либо полиплоидия).
Метафаза – хромосомы образуют пластинку, микротрубочки достигают max концентрации и перекрываются.
АНАФАЗА
Анафаза – хромосомы внезапно одновременно отделяются друг от друга и начинают движение к полюсам. Центромеры разъединяются – деградация центромерных когезинов. Наиболее короткая стадия, разделение хроматид и расхождение хромосом к полюсам (v=0,2-5 мкм/мин). Иногда также расходятся полюса друг от друга.
Расхождение хромосом за счет кинетохорных пучков микротрубочек – анафаза А, расхождение хромосом вместе с полюсами за счет удлинения межполюсных микротрубочек – анафаза В.
Разделение хроматид и движение к полюсам.
Веретено и перетяжка связаны так, что пока хромосомы не разойдутся перетяжка цитоплазмы не наступает.
События анафазы: движение кинетохорных нитей к полюсам, движение полюсных нитей расталкивающих полюсы-движутся друг относительно друга; малые дозы хлоралгидрата предотвращают удлинение и движение полюсных нитей, но не влияют на кинетохорную нить.
ТЕЛОФАЗА.
Телофаза длится с момента прекращения движения хромосом. Происходит реконструкция ядер - образование ядерной оболочки, деспирализация хромосом, активация хромосом - увеличение уровня транскрипции, формирование ядрышек, разрушение веретена деления, разделение клеток, образование остаточного тельца Флеминга, образование перетяжки.
В местах контактов хромосом с мембранными пузырьками начинает образовываться ядерная оболочка. Сначала она образуется на латеральных поверхностях хромосом, затем в центромерных и теломерных участках. После смыкания ядерной оболочки происходит образование ядрышек.
Разборка микротрубочек идет от полюсов к экватору бывшей клетки, в средней части веретена микротрубочки сохраняются дольше всего – остаточное тельце.
Цитокинез.
Борозда деления образуется в плоскости метафазной пластинки под прямым углом к длинной оси митотического веретена. Перетяжка содержит актиновые филаменты и миозин II, расположенные по экватору делящейся клетки под плазматической мембраной (ПМ) стягивая ее изнутри.
Одной из причин почему цитокинез не происходит раньше окончания митоза является активность M-Cdk инактивируемой в конце митоза.